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荧光成像技术已逐渐成为一种新的、有前景的活体可视化检测工具。由于它可以提供实时亚细胞分辨率成像结果,因此可以广泛应用于生物检测和医学检测和治疗领域。传统的生物光学成像方法主要在可见光(400–700 nm)区域进行。然而,当在可见光区域成像时,会受到严重的组织散射、吸收和自体荧光干扰,导致空间分辨率、成像灵敏度和对比度降低。近红外(near-infrared,NIR)成像系统是一种用于心理学、基础医学、临床医学、工程与技术科学基础学科领域的医学科研工具,其以生物组织光学特性为基础,结合光在组织中的传播规律,研究光在组织中历经一系列吸收,散射后折射光携带的与组织光学特性相关的生化信息。新思界产业研究中心出具的《2021年全球及中国近红外成像系统产业深度研究报告》显示,全球近红外成像系统市场规模将从2021年的8.5亿美元增长到2026年的17.1亿美元,复合年增长率为15.0%。基于近红外Ⅱ区(900～1700nm)波段的荧光成像因其低散射的优势,能提供高分辨率的生物体血管和器官的细节,近年来已成为研究热点。

荧光成像已成为生物医学应用的基本工具,但其在传统波长范围(400–950 nm)内的活体成像能力因其组织穿透力极为有限而受到限制。为了应对这一挑战,在过去十年中,科研人员开发了一种利用第二近红外窗口(NIR-II,1000–1700 nm)荧光的新型成像方法,以实现组织深度穿透和高保真成像。

组织中存在丰富的微血管(直径<1mm,包括毛细血管、微动脉和微静脉),其运输的红细胞携带有近红外光在组织中的主要吸收体:血红蛋白。随着组织的有氧代谢,氧合血红蛋白和脱氧血红蛋白的含量会不断发生变化,因而组织中的血氧含量的变化能够反映出机体生理状态、细胞的活动变化以及各组织结构的功能情况。血红蛋白散射光、吸收的红外光与散射的红外光的比率会根据血红蛋白与氧气结合的程度而变化。近红外光在穿过微血管后,光强就会减弱,血红蛋白浓度越高,光强减弱就越明显。通过光学探头贴附组织以发射和接收近红外光的方式,可以测量出脱氧血红蛋白和氧合血红蛋白的浓度变化,或者两者总和浓度的绝对或相对变化。例如脑功能活动的变化会引起局部脑血流的变化。大脑皮层在被激活时会引起局部氧代谢率和局部脑血流的动力学改变。具体来说,人在静息状态时,局部脑组织氧代谢和局部脑血流供养水平相当;而当人大脑在激活状态时,局部脑血流增加率远超过局部氧代谢率,故表现为大脑被激活区域中氧合血红蛋白含量相对增加,脱氧血红蛋白含量相对减少。

传统的第一近红外(NIR-I)窗口(NIR-I,700-900 nm)成像技术已经有20多年的历史,并被广泛应用于临床诊断、治疗和科学研究。与NIR-I相比,第二近红外窗口(NIR-II,1000-1700 nm)技术具有低自发荧光、高信噪比、高组织穿透深度和更大的斯托克斯位移,可以减少组织光子吸收、组织自体荧光和散射,实现更高的保真度和空间分辨率效应。NIR-II生物成像能够探索厘米范围内的深层组织信息,并在毫米深度获得微米级分辨率,超过了NIR-I荧光成像的性能。近年来,NIR-II成像技术引起了人们的广泛关注,并成为生物医学领域的一个研究热点。

小鼠脑血管NIR-I区荧光成像(左)和NIR-II区荧光成像(右)

自2009年以来,基于有机、无机和杂化材料体系的NIR-II荧光团的设计和构建取得了重大进展。代表性荧光材料包括单壁碳纳米管(SWCNT),量子点(QD),稀土掺杂纳米颗粒(RENPs),半导体聚合物纳米颗粒(SPNP),小分子染料(SMD),和聚集诱导发射发光剂(AIEgens)等,极大地扩展了目前可用于生物医学应用的荧光团的范围。自2011年以来,许多NIR-II区荧光成像系统也不断被开发应用于生物医学领域,包括NIR-II活体成像系统,NIR-II共聚焦显微成像系统,NIR-II双光子成像系统,NIR-II光片成像系统等。

NIR-II 荧光成像技术主要里程碑时间表

随着患有心脑血管疾病患者的数量增加,被用来检测这些疾病的检查技术能力也随之提高。临床血管造影中常用的技术包括B超、CT扫描和核磁共振(NMR)。然而,这些技术是非肿瘤特异性的,灵敏度低,成本高,不能用于外科手术的实时检测或临床实践。近年来,一些研究小组设计了NIR-II荧光探针,并将其静脉注射到小鼠体内,然后使用NIR-II荧光在体内进行血管成像。结果表明,NIR-II荧光能更深入地穿透小鼠颅骨,不仅能成像小鼠头部血管的分布,还能清晰地显示毛细血管的精细结构。 

使用NIR-II发射荧光团进行结构和功能成像。

(a) 基于Ag2S量子点的NIR-II对裸鼠进行全身血池成像。

(b) 用于体内淋巴成像的Ag2S量子点(上图)和ICG(下图)的对比研究。

(c) 在NIR-II窗口中对肿瘤血管和肿瘤组织进行双色荧光成像。p-EF通道:肿瘤血管;CNT通道:肿瘤。

(d) 恒河猴脑血管的3D共焦图像。棒:100μm.

(e)使用宽视野NIR-II显微镜对恒河猴的血流速度进行活体成像。

每种成像技术都有其独特的优势和固有的局限性。例如,荧光成像具有出色的灵敏度,但在混浊介质中组织穿透和空间分辨率较低。MRI、CT 扫描和超声成像具有更好的空间分辨率,但它们的灵敏度有限。PET-CT扫描的灵敏度较高,但不能提供成像材料的结构信息。因此,融合两种或多种成像技术的多模式成像可以补充成像信息,准确诊断疾病。为了满足多模成像的需要,研究人员通常将荧光纳米材料与功能化的小分子或颗粒通过掺杂、键合、包覆等方式结合,制成多功能纳米颗粒,NIR-II窗口内的深层组织成像在生理研究和生物医学应用中具有广阔的前景。活体复用技术(in vivo multiplexing technology, IVM)已被用于诊断活体动物中的肿瘤亚型。

肿瘤生物标记物时间分辨成像的IVM技术。将三组具有不同寿命的Er纳米粒与三种抗体(抗Er、抗PR和抗HER2)结合,并通过尾血管移植到小鼠体内。然后通过IVM完成时间分辨成像,以定量分析肿瘤上的生物标记物表达。 

到目前为止,手术切除仍然是肿瘤最基本、最标准的治疗方法。因此,在肿瘤手术中可视化肿瘤组织边界和发现周围转移的能力将对治疗预后起到至关重要的作用。由于其无创性和高时空分辨率,术中光学成像已被广泛用于帮助外科医生快速准确地进行手术。最近,NIR-II 成像引导的手术方法在动物研究和临床实践中极大地提高了肿瘤手术的准确性、敏感性和特异性。Hu 和他的同事完成了第一个 NIR-II 成像引导的人体肿瘤手术。在他们的研究中,FDA 批准的 ICG 被用作荧光团。因此,ICG 的 NIR-I 和 NIR-II 发射可以通过集成在光学成像仪器中的不同检测器同时检测。在一项针对 23 名患者的肝肿瘤手术试验中,术中 NIR-II 成像显示出比术中 NIR-I 成像更好的肿瘤检测灵敏度、更高的 TBR 和更高的肿瘤检出率。凭借这些独特的优点,新的 NIR-II 成像策略可能在未来改善术前诊断和术中导航方面具有巨大潜力。

NIR-II成像引导治疗。在可见光和NIR-I/II窗口的多光谱光学成像指导下的人类肝脏肿瘤手术中。

药物的靶向输送和精准释放是精准医疗领域的主要挑战。NIR-II 成像为体内监测药物递送和释放提供了一种有前途的工具,从而促进药物开发和药物递送的优化。到目前为止,用于按需药物释放的智能纳米平台已得到广泛研究,因为它们能够精确控制装载药物的剂量和位置,从而在最大限度地提高治疗效果的同时最小化副作用。这些纳米平台可以实现对特定刺激(如pH、光和生物分子)的按需药物释放。在上述刺激中,光具有易遥控性、无创性和高时空分辨率等优势。因此,基于近红外光响应的纳米平台在精确疾病治疗中具有巨大潜力。例如,Shi等人报道了一种一体化纳米平台(NPs@BOD/CPT)。它由硼二吡咯乙烯(InTBOD Cl)制成,H2S可触发其发射近红外光,以实现癌症治疗的光控按需药物释放。H2S会触发近红外光热剂的产生。这些光热剂将光能转化为热能,从而将温度提高到共晶熔点以上,导致相变并触发负载药物的释放。此外,H2S还激活了超亮NIR-II发射,实现了富含H2S的癌症诊断和光控按需药物释放。

NPs@BOD/CPT用于肿瘤NIR-II荧光成像和药物释放的示意图

干细胞(Stem cell,SC)是一类具有自我复制能力的多能干细胞,在一定条件下可分化为多种功能细胞。SC疗法是治愈多种人类疾病的希望。在干细胞治疗过程中,如何实时无创地观察移植的干细胞已成为实验和临床研究的挑战。基于外源性标记物的近红外成像一直是体内追踪干细胞的最佳方法之一。近年来,近红外荧光探针凭借其强大的生物穿透能力、较低的光子检测域值、较高的检测灵敏度、相对简单的操作以及手术过程中实时成像的优势,实现了从NIR-I窗口到NIR-II窗口的发射转移,以跟踪移植的干细胞。例如基于Ag2S量子点的NIR-II成像是目前唯一一种在体内成功进行干细胞追踪研究的方法。

NIR-II用于追踪移植的干细胞。(A)用Ag2S量子点标记急性肝衰竭小鼠骨髓间充质干细胞。将骨髓间充质干细胞联合或不联合肝素注射到小鼠体内,并进行成像。通过(B)活体成像和(C)荧光定量研究骨髓间充质干细胞的归巢。将骨髓间充质干细胞静脉移植到皮肤创伤小鼠模型中。左侧创伤用含有SDF1-α的胶原支架治愈。右侧创伤用胶原支架治愈。

随着新型NIR-II探针和NIR-II成像系统的发展,NIR-II成像已成为体内深部组织结构和功能分析以及指导精确治疗的强大成像工具。相信在未来NIR-II成像将有助于广泛的基础和临床研究:

  对于肿瘤学研究,NIR-II成像为活体内三维结构、血管分布、血流和肿瘤中动态免疫细胞浸润过程的成像提供了可能。通过结合多种内源性和外源性NIR-II探针,进一步发展多种光谱成像方法,将为全面分析肿瘤的发生、发展和转移提供一种独特的工具,从而为肿瘤的精确诊断和治疗提供理论依据。

  在再生医学领域,无创NIR-II成像也将在探索基本生物学问题方面发挥重要作用,如胚胎和器官的发育过程以及干细胞的谱系和命运。应用多光谱NIR-II成像技术可以提供丰富的成像通道,同时监测干细胞的易位、活力、旁分泌、分化和老化,从而全面了解干细胞再生的过程和潜在机制。

  对于神经科学研究而言,NIR-II成像也具有广阔的应用前景。例如,进一步开发膜电位敏感的NIR-II探针可能会提供以亚毫秒时间分辨率和亚细胞空间分辨率同时监测深层组织中大量神经细胞群的神经活动的可能性。

  就临床应用而言,NIR-II成像最有希望的应用是图像引导的肿瘤手术;在未来,先进的NIR-II成像技术可能会大大提高肿瘤手术的精度和预后。此外,与FDA批准的基于ICG的NIR-I成像相比,NIR-II成像在组织穿透深度和时空分辨率方面具有优越的性能,因此在临床心血管疾病的精确诊断和治疗方面也具有巨大潜力。

随着纳米医学科学的快速发展,越来越多的荧光探针将被设计、研究和应用。但值得注意的是,NIR-II 光学成像技术仍处于初级阶段,目前还面临着一系列的问题。首先,许多有机 NIR-II 纳米探针在水中不稳定,因为共轭骨架会受到水等反应性物质的攻击。此外,许多现有有机染料的发射波长仅略高于 1000 nm,荧光量子产率较低,仅为 0.3-2% 左右。需要尽可能地将探针的带隙减小到红移波长,以保持其在水溶液中的稳定性。其次,要充分了解NIR-II纳米探针在体内的生物相容性、代谢途径和长期毒性。只有当 NIR-II 纳米探针具有出色的生物相容性和可接受的清除特性(类似于临床批准的 NIR-I 染料,如亚甲蓝和 ICG)时,才能实现临床批准和转化。因此,有必要明确探针的生物毒性及其在体内的代谢途径。第三,提高纳米探针的量子产率(QY)非常重要。这是评价荧光探针光学性能的指标。荧光染料的QY越高,荧光寿命越长。因此,高QY可以使荧光探针发出强烈的荧光信号,可以有效提高光学成像的灵敏度。然而,大多数 NIR-II 探针的 QY 较低,尤其是在水溶液中。最后,NIR-II 成像设备的设计和优化也是必要的。传统的NIR-II光学成像系统存在视场小、分辨率低、穿透深度不足等缺点。这些缺点将限制 NIR-II 光学成像的应用。因此,应加大力度开发和优化NIR-II成像系统的功能。

参 考 文 献

1. Li C, Chen G, Zhang Y, et al. Advanced fluorescence imaging technology in the near-infrared-II window for biomedical applications[J]. Journal of the American Chemical Society, 2020, 142(35): 14789-14804.

2. Zhang N, Lu C, Chen M, et al. Recent advances in near-infrared II imaging technology for biological detection[J]. Journal of Nanobiotechnology, 2021, 19(1)

3. Cao J, Zhu B, Zheng K, et al. Recent progress in NIR-II contrast agent for biological imaging[J]. Frontiers in bioengineering and biotechnology, 2020: 487.

4. Hu Z, Fang C, Li B, et al. First-in-human liver-tumour surgery guided by multispectral fluorescence imaging in the visible and near-infrared-I/II windows[J]. Nature biomedical engineering, 2020, 4(3): 259-271.

文案 | 灵犀 

审核 | 李迪迪 刘泽鹏 杨敬丽